TMT标记定量蛋白质组学技术

TMT技术是技术是由美国Thermo Scientific公司研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用2种、6种或10种同位素的标签,特异性标记多肽的氨基基团,经过串联质谱LC-MS/MS分析,可同时比较2组,6组或最多10组不同样品中蛋白质的相对含量。

技术原理

TMT?标签由三部分组成:分子量报告子、分子量标准化部分和反应基团, 质量报告基团有2/6/10种不同的分子量,质量标准化基团也2/6/10有种不同的分子量,与不同的报告基团搭配形成2种、6种或10种相对分子质量均等量的异位标签。保证被标记的不同来源的同一肽段在一级质谱中具有相同的质荷比;氨基反应基团能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接使肽段连上标记。

                                                             

                                                                                  TMT?标签结构示意图    

实验流程  

 TMT?试剂通过反应基团能够高效地标记酶解后的肽段。在一级质谱图中,分子量标准化部分使任何一种TMT?试剂标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比。在串联质谱中,可剪切臂能够优先断裂以便释放分子量报告子。每个报告子都有各自独特的分子量,并且能够在MS/MS分析中反应出所标记的多肽的样品丰度,根据报告离子的信号强度值可获得样品间相同肽段的定量信息,再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。

                                                              

                                                                            TMT实验流程图(以6标为例)

技术路线

                                   

技术优势 

      灵敏度高:可检测出低丰度蛋白; 

      分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白,小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等; 

      适用范围广:可以对任何类型的蛋白质进行鉴定,包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等; 

      高通量:可同时对10个样本进行分析,特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析; 

      结果可靠:定性与定量同步进行,同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息; 

      自动化程度高:液质连用,自动化操作,分析速度快,分离效果好。                                                                                         

     应用领域 

科研: 研究特定疾病发生的遗传变异,如单基因遗传病、罕见疾病基因检测等。 

农业: 用于品系鉴定、优势性状筛选、群体遗传学分析、亲缘关系分析等 

动植物: 动植物生长发育、抗病、抗逆机制研究以及育种研究。同时可实时更新和补充关联信息的完整性 

医学: 阐释疾病的发生发展机制,发现与疾病相关的生物标志物, 以应用于疾病诊断、治疗、预后及用药研究。

仪器类型

Thermo Scientific Q Exactive、AB SCIEX Triple TOFTM fusion plus

样品要求 

1.蛋白运输:24小时内可以4℃运输;

2.蛋白长期保存:-20℃;

3.待检测蛋白要求:蛋白量最低300μg,浓度最低要求为1μg/μl,否则同位素无法标记;

4.蛋白提取试剂要求:使用普通的组织、细胞裂解液即可,切忌不要使用二维电泳试剂提取;

5.直接提供组织或细胞:动物、微生物组织湿重>10mg;植物鲜嫩组织>100mg;细胞量>107个;血液体积>500μl。 

 


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